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ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE PLANTAS

(REVISTA CIENTÍFICA (2008)

de la Universidad Científica del Sur, Lima Perú

Jorge Araujo Díaz ; Ramsés Salas Asencios)

 

RESUMEN

 

Se realiza una revisión de los principales compuestos con actividad antimicrobiana que se pueden obtener a partir de extractos de plantas y derivados de ellas. Además, se describen las características y algunos resultados obtenidos a partir del uso de los dos principales métodos de evaluación de la actividad antimicrobiana: el turbidimétrico y el ensayo por difusión en placa.

Palabras clave: Actividad antimicrobiana, extractos de plantas, ensayo turbidimétrico, difusión en placa.

 

INTRODUCCIÓN

 

Desde hace unos años, el empleo de plantas medicinales y de productos derivados de las mismas está aumentando de manera importante. Esto se debe a una serie de factores, entre los cuales debemos destacar en muchos casos el conocimiento preciso de su composición química, y el hecho de que en la actualidad dicha utilización se fundamenta en numerosos ensayos farmacológicos in vivo como in vitro, así como en ensayos químicos.

De esta forma, el uso de las especies vegetales medicinales que se ha venido haciendo en forma empírica y basada en la tradición tiene hoy una base científica.

Una planta medicinal es considerada como un complejo laboratorio de síntesis y degradaciones en el que generalmente coexisten componentes con diversas estructuras químicas, y su efecto en muchas ocasiones se debe a varios de estos componentes. Además de los principios activos que son en su mayor parte metabolitos secundarios, en las plantas se encuentran los metabolitos primarios y una serie de sustancias consideradas inertes con función plástica.

La farmacopea peruana tiene muchas plantas con aplicaciones curativas. Diversos investigadores han señalado que existen más de 3,000 especies, por lo que la cantidad abrumadora de medicinas originadas por este tipo de plantas debiera convencer a los científicos del valor y alcance de la investigación etnobotánica, ecológica, fitogeográfica, fitoquímica y farmacológica, a fin de lograr su validación científica.

El objetivo del presente trabajo es resaltar la importancia de las plantas como productoras de compuestos antimicrobianos, presentando los principales componentes químicos que se pueden aislar con esta actividad, así como la principal metodología para analizarla experimentalmente.

 

I. PLANTAS ANTIMICROBIANAS

Aproximadamente, el 60% de la población mundial utiliza plantas y productos derivados de ellas en su medicación. Estos productos naturales hoy en día son considerados como una de las “medicinas” de gran importancia por su efectividad terapéutica. De las 520 nuevas drogas aprobadas entre 1983 y 1984, el 39% fueron productos naturales o derivados de productos naturales, y el 60 a 80% de drogas antibacterianas y de anticancerígenos son derivados de productos naturales.

Por ejemplo, del desarrollo de drogas no proteicas se han obtenido derivados generados de productos naturales como la sinvastatina, lovastatina, enalapril, ciprofloxacina y ciclosporina, entre otros, y agentes anticancerígenos como el taxol y docetaxol (Harvey, 2000).

Sin embargo, la actividad terapéutica no sólo se puede conseguir luego de procesos de extracción y purificación de principios activos, sino directamente de la planta misma o de algunos extractos relativamente simples de obtener. Por ejemplo, el jugo de arándano tiene una acción de prevención de las recurrencias sintomáticas de infección al tracto urinario; el consumo diario de 300 ml reduce la bacteriuria en mujeres post-menopáusicas pero no en niñas con vejiga neurogénica (Kontiokari y col., 2001).

 En un estudio de acción inhibitoria de crecimiento antimicrobiano, se mostró que la asociación de extractos acuosos de 2 plantas, Erythroxilum novogranatense variedad truxillense “Hoja de Coca de Trujillo” y Plantago major, presentaron sinergismo, comparado con el estudio realizado por separado de cada uno de los extractos; se realizaron las determinaciones fitoquímicas en muestras de ambas especies y los extractos acuosos fueron esterilizados separadamente mediante filtros Milipore para realizar las determinaciones de acción inhibitoria de crecimiento frente a bacterias y hongos, encontrándose una proporción de asociación para los dos extractos acuosos empleados de 50:50, considerándose como óptimo para este estudio (Bazalar y col., 1998).

Ocinum micranthum W., planta conocida como “sanialbahaca”, es utilizada para tratar infecciones respiratorias en regiones amazónicas de América del Sur, México y el Caribe. Se determinó la composición química del aceite esencial de las hojas de dicha planta, y también se la enfrentó a bacterias como Klebsiella pneumoniae, S. aureus, E. coli, Bacillus cereus, Shigella sp., y hongos del género Aspergillus, confirmándose que dicho aceite puede ser considerado como un buen agente antibacteriano y antifúngico (Fuertes y col., 1997).

Los ácidos ceanótico y ceanotérico, provenientes de la planta Ceanothus americanus, han demostrado efectos inhibidores del crecimiento de Streptococcus mutans, Actinomyces viscosus, y Porphyromonas gingivalis; y los extractos etanólicos del propóleo han mostrado buena actividad antimicrobiana contra estos mismos microorganismos orales (Katsura y col., 2001).

Los extractos crudos de Psoralea corylifolia, un árbol nativo de China, poseen actividades reportadas antimutagénicas, antimicrobianas y de hormona juvenil de insectos; además, un extracto aceitoso en hexano obtenido a partir de sus semillas presentó actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus. Se ha considerado que el responsable de estas actividades es el bakuchiol, un isoprenoide fenólico aislado de las semillas y hojas de esta planta (Katsura y col., 2001).

Es común el empleo de partes vegetales con la finalidad de obtener varios efectos terapéuticos y que han sido respaldados por estudios científicos. Entre las variadas aplicaciones terapéuticas de los vegetales se incluye la acción antibacteriana. Los hallazgos obtenidos del estudio de vegetales con potencial terapéutico podrán servir como instrumento de apoyo médico-social para un mayor grupo poblacional, principalmente el más carente, estando también la industria farmacéutica más interesada en los conocimientos de esta área (De Paula y Martínez, 2000).

Nuevas fuentes de productos antimicrobianos, especialmente fuentes vegetales, están siendo investigadas. El público hoy en día tiene más problemas con la sobreprescripción y el mal uso de antibióticos tradicionales. Además, mucha gente está interesada en tener más autonomía sobre su cuidado médico. Una multitud de componentes vegetales se encuentra fácilmente disponible a través de los comercializadores de plantas y productos naturales, tiendas naturistas, con lo que la automedicación con estas sustancias se hace cada vez más común. El uso de extractos de plantas, como también de otras formas alternativas de tratamientos médicos, tomó gran popularidad a finales de la década de 1990. En 1996 se reportó que las ventas de medicinas botánicas se incrementaron en un 37% con respecto a 1995 (Cowan, 1999).

 

II. GRUPOS PRINCIPALES DE COMPONENTES ANTIMICROBIANOS DE LAS PLANTAS

 

Las plantas tienen una casi ilimitada habilidad de sintetizar sustancias aromáticas, gran cantidad de ellas son fenoles o sus derivados de oxígenos sustituidos. Muchos son metabolitos secundarios de los cuales por lo menos 12000 han sido aislados, un número estimado menor en un 10% del total.

En numerosos casos estas sustancias sirven como mecanismos de defensa de las plantas contra la predación por microorganismos, insectos y herbívoros. Algunos, tales como los terpenoides, dan a las plantas sus olores; otros (quinonas y taninos) son responsables del pigmento de las plantas. Muchos componentes son asimismo responsables del sabor de las plantas (el terpenoide capsaicina en caso del ají), y algunas de las hierbas y especies usados por los humanos para sazonar los alimentos producen compuestos medicinales útiles.

Los compuestos fitoquímicos antimicrobianos útiles pueden ser agrupados en varias categorías, como las siguientes:

a. Fenoles y Polifenoles: El ácido cafeico (Fig. 1) y el cinámico son representantes de estos grupos, ambos con acción antimicrobiana, antiviral y antifúngica. También se pueden mencionar a los fenoles simples y ácidos fenólicos, catecoles  y eugenoles (estos últimos considerados bacteriostáticos).

La actividad antimicrobiana del catecol y del pirogallol está directamente relacionada con el número de grupos hidroxilos que tiene el derivado fenólico. También están las quinonas (como las antraquinonas con acción bactericida para Pseudomonas), flavones, flavonoides, flavonoles y catequinas. Parte de los flavonoides inhiben in vitro el crecimiento de V. cholerae, Streptococcus y otras bacterias. Los flavonoides también exhiben actividad antiviral; los taninos presentan actividad astringente. Se considera que la acción de los fenoles y polifenoles contra los microorganismos se debe a la inhibición enzimática posiblemente por acción sobre los grupos sulfihidrilos de sus aminoácidos de cisteína o por medio de reacciones más inespecíficas con proteínas bacterianas.

Los compuestos fenólicos que poseen una cadena lateral a nivel de C3 en un bajo nivel de oxidación y que no contienen oxígeno, son clasificados como aceites esenciales y a veces se citan como agentes antimicrobianos bacteriostáticos contra hongos y bacterias (Cowan, 1999).

Katsura y col. (2001) purificaron bakuchiol  a partir de semillas de Psoralea corylifolia y en solución con DMSO al 5%. El análisis de la actividad antimicrobiana se realizó leyendo absorbancias a 610 nm (turbidez) de cultivos microbianos incubados por 24 hrs. Para determinar un posible crecimiento posterior al enfrentamiento con bakuchiol (conteo de células viables), se tomaron alícuotas de estas muestras diluidas en presencia de Tween 80 (para inactivar el bakuchiol) y se sembraron en placa, incubándose por 48 horas para leer Unidades Formadoras de Colonias (UFC).

Hubo una inhibición de crecimiento de S. mutans directamente proporcional a la concentración de bakuchiol, encontrándose una actividad bacteriostática in vitro a una concentración de 5 µg/ml y una actividad bactericida in vitro a 20 µg/ml. El efecto bactericida del bakuchiol fue dependiente del tiempo y la producción de glucanos insolubles en agua (principal factor de virulencia para S. mutans) fue prácticamente inhibida.

También se analizó la actividad antimicrobiana del bakuchiol contra diferentes especies de bacterias, incluyendo Streptococcus mutans, S. sobrinus, Porphyromonas gingivalis, Enterococcus faecalis, E. faecium, Lactobacillus  acidophilus, L. plantarum, L. casei, S. sanguis, S. salivarius, Actinomyces viscosus, generando diversos valores del MIC que van desde 1.0 hasta 4.0 µg/ml y una concentración esterilizante entre los 5.0 hasta los 20.0 µg/ml.

b. Quinonas: Son anillos aromáticos con dos sustituciones cetónicas. Se encuentran en amplia distribución en la naturaleza y son altamente reactivos en reacciones de óxido-reducción. Producen radicales libres y generan complejos irreversibles con aminoácidos nucleofílicos de las proteínas, generando su inactivación.

El rango de la actividad antimicrobiana de las quinonas  es amplio, actuando posiblemente sobre las adhesinas expuestas en la superficie de las bacterias, sobre los polipéptidos de la pared celular y sobre las enzimas unidas a membranas (Cowan, 1999). Por ejemplo, una antraquinona proveniente de Cassia italica, un árbol de Paquistán, tiene acción bacteriostática sobre Bacillus anthracis, Corynebacterium pseudodiphthericum y Pseudomonas aeruginosa, y tiene acción bactericida sobre Pseudomonas pseudomalliae. La Hipericina (Fig. 2) es una antraquinona extraída de Hypericum perforatum que ha sido descrita como un antidepresivo, pero tiene también actividades antimicrobianas.

Plantas de la familia Borraginácea se han caracterizado por producir naftoquinonas en sus raíces, las cuales han sido utilizadas en numerosas culturas indígenas como colorantes en cosméticos y alimentos, y para aplicaciones medicinales por su actividad antitumoral, antiinflamatoria y antimicrobiana (Brigham y col., 1999).

c. Flavonas, flavonoides y flavonoles: Son estructuras fenólicas que contienen un solo grupo carbonilo. Estos compuestos son sintetizados por las plantas en respuesta a la infección antimicrobiana, y su actividad sobre las bacterias probablemente se deba a su capacidad de generar complejos con proteínas extracelulares y proteínas solubles, así como una actividad sobre la pared celular muy similar a la de las quinonas. Los flavonoides lipofílicos pueden perturbar la integridad estructural de la membrana celular (Fuertes y col., 1997).

Las catequinas derivados de los flavonoides, han sido estudiadas como los compuestos que generan la actividad antimicrobiana in vitro en el té verde, sobre Vibrio cholerae O1, Streptococcus mutans y Shigella, principalmente. Las catequinas tienen una actividad inactivadora sobre la toxina de Vibrio cholerae e inhibe las glicosil transferasas en S. mutans.

Ratas de laboratorio que recibieron en su dieta 0.1 % de catequinas del té, redujeron en un 40% la presencia de caries inducida (Cowan, 1999).

d. Taninos: Conforman un grupo de sustancias fenólicas poliméricas capaces de precipitar gelatina en solución, una propiedad conocida como astringente. Están divididas en dos grupos: hidrolizables y condensados. Los taninos hidrolizables están basados en el ácido gálico, usualmente como ésteres múltiples con la D-glucosa, mientras que los taninos condensados más importantes (a veces llamadas proantocianidinas) son derivados de monómeros flavonoides.

Se ha considerado que los taninos, en muchas bebidas como el té verde y el vino, tienen actividades reforzadoras de la salud (estimulación de la actividad fagocitaria, actividad antitumoral mediada por el hospedero y un amplio rango de actividad antiinfecciosa). En las plantas, los taninos tienen una acción inhibitoria del crecimiento de insectos y perturban la digestión de rumiantes. Se cree que la actividad antimicrobiana de estos compuestos se debe a su interacción sobre las adhesinas, proteínas de la pared celular, y a su capacidad de unirse a polisacáridos (Cowan, 1999).

Las plantas de las especies de Vaccinium contienen taninos condensados llamados proantocianidinas. Estas sustancias son compuestos fenólicos estables que pueden prevenir la expresión de las fimbrias P de E. coli dentro de sus actividades antibacterianas, y además tienen actividades antivirales, antiadherentes o antioxidantes (Kontiokari y col., 2001).

e. Cumarinas: Son compuestos de los cuales se conoce muy bien su acción antitrombótica, antiinflamatoria y vasodilatadora. Un gran ejemplo de estos compuestos es la warfarina (Fig. 4), usada como un anticoagulante oral y como un rodenticida. Se ha visto que tiene acción antiviral, asimismo, otras cumarinas tienen actividad antimicrobiana sobre Candida albicans en trabajos in vivo en conejos.

Estos trabajos fueron realizados en vista de las crónicas que, en 1954, indicaban el uso de cumarinas en lavados vaginales para el tratamiento de candidiasis en mujeres gestantes. Sin embargo, su uso interno es discutido por sus efectos contraceptivos en animales (Cowan, 1999).

f. Terpenoides y aceites esenciales: Los terpenos o terpenoides son activos contra bacterias, virus, hongos y protozoarios. Se ha reportado que los terpenoides actúan contra Listeria monocytogenes. Se cree que esta actividad antimicrobiana se debe a una perturbación de la estructura de la membrana celular por su naturaleza lipofílica. La capsaicina (Fig. 5) tiene actividad bactericida sobre Helicobacter pylori; aunque tiene un poder muy irritante sobre la mucosa gástrica, se ha demostrado que afecta el sistema nervioso, el cardiovascular y el digestivo. Se ha sugerido que la capsaicina también podría incrementar el crecimiento de Candida albicans.

El ácido betulínico es un triterpenoide que muestra actividad inhibitoria del virus VIH. El petalostemumol presenta una actividad excelente contra Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus, aunque tiene una menor actividad sobre bacterias Gram negativas y Candida albicans. Por otro lado, los terpenos previenen la formación de úlceras gástricas y disminuyen la severidad de las úlceras existentes, aunque no se sabe a ciencia cierta si esta actividad se debe o no a su acción antimicrobiana (Cowan, 1999).

g. Alcaloides: Los Glicoalcaloides de especies de Solanum podrían ser útiles contra la infección por VIH y también contra las infecciones intestinales relacionadas con el SIDA. Otros alcaloides tienen efecto contra parásitos como Giardia y Entamoeba. La berberina (Fig. 6) es un alcaloide representativo por su actividad potencialmente efectiva contra Tripanosoma y Plasmodium. Se ha descrito que tiene actividad microbicida (por ejemplo, sobre Giardia y Entamoeba), pero se cree que su acción antidiarreica probablemente se deba a sus efectos sobre el tiempo de tránsito del bolo alimenticio en el intestino delgado (Cowan, 1999).

h. Lectinas y Polipéptidos: La actividad antimicrobiana de los péptidos fue descrita por primera vez en 1942. Tienen a veces grupos con carga positiva y contienen enlaces disulfuro entre residuos de cisteína. Su mecanismo de acción principalmente se explica como la formación de canales iónicos en la membrana del microorganismo o la inhibición competitiva de la adhesión de proteínas a los receptores polisacáridos del hospedero. Un reciente interés se ha enfocado en estudiar la actividad anti–VIH de péptidos y lectinas. Las tioninas son péptidos tóxicos para levaduras y bacterias Gram positivas y Gram negativas, como por ejemplo las Fabatinas que inhiben el crecimiento de Pseudomonas, E. coli, Enterococcus, etc.

Los péptidos cíclicos son pequeños en tamaño y número de aminoácidos (por lo general menos de 15 aminoácidos) y son sintetizados por bacterias y plantas. También se han encontrado péptidos grandes cíclicos unidos por los extremos de 29 a 31 aminoácidos en plantas de la familia Rubiaceae (café).

Estos péptidos contienen seis residuos de cisteína que pueden ser alineados y comparten un 45% de homología de secuencia (Fig. 7). Entre ellos se tiene a la circulina A y B del árbol tropical africano Chassalia parviflora, la ciclopsicotride de la planta tropical de Sudamérica Psychotria longipes, y la kalata de la planta africana Oldenlandia affinis (Tam y col., 1999).

Estos péptidos macrocíclicos tienen también en común un tipo inhibidor de motivo estructural nudo de cisteína, el cual contiene un patrón de enlaces disulfuro entre los residuos de cisteína I-IV, II-V, y III-VI. Estos motivos estructurales, junto con una estructura de hoja beta con tres cadenas, también han sido hallados en toxinas peptídicas e inhibidores de proteasas de diversos orígenes.

Las circulinas A y B fueron descubiertas durante un programa de pruebas de actividad anti-VIH de diversos compuestos, al igual que la kalata y la ciclopsicotride en pruebas de nuevas sustancias antibióticas. Aunque la kalata presentó acción uterotónica y la ciclopsicotride presentó inhibición de la unión de la neurotensina a su receptor, no se sabe mucho de la función que cumplen estos péptidos en las plantas. La kalata mostró una fuerte actividad antimicrobiana contra bacterias Gram positivas, particularmente S. aureus (MIC 0.26 µM), mientras que su actividad fue moderada contra Gram negativas del género Klebsiella y hongos del género Candida. La circulina A tuvo una actividad similar a la kalata, pero mostró una acción más potente contra S. aureus (MIC 0.19 µM), aunque no tuvo actividad contra Micrococcus luteus.

Estos péptidos macrocíclicos son diferentes a las defensinas vegetales de cadena abierta, que son de mayor tamaño. Los macrocíclicos son más pequeños, compactos y rígidos en cuanto a estructura (Friedrich y col., 1999).

 

III. OTRAS ACTIVIDADES ANTIMICROBIANAS

Recientemente, investigaciones químicas llevadas a cabo sobre algas marinas (rodofitas o algas rojas, feofitas o algas pardas, clorofitas o algas verdes, cianofitas o cianobacterias, y dinoflagelados) han demostrado que estos organismos producen una amplia variedad de metabolitos secundarios biológicamente activos, con estructuras moleculares únicas, no encontradas en otros organismos, los cuales han mostrado ser capaces de inhibir el crecimiento de ciertas bacterias, virus y hongos.

En cuanto a la actividad antibiótica de las microalgas, se pueden nombrar algunos de estos compuestos que ya han sido identificados: ácido acrílico obtenido en la microalga Phaeocystis, ácido .-linolénico en los extractos metanólicos de Spirulina platensis, Chlorococcum, Dunaliella primolecta, amfidinol 2, hidroxilpolieno en el extracto del dinoflagelado Amphidinium klebsii. Las microalgas, y más específicamente las cianobacterias (algas azul-verdosas), constituyen una importante fuente de compuestos antivirales.

Un estudio reciente de 600 especies de cianofitas mostraron que cerca del 10% de los extractos probados tuvieron actividad contra el virus Herpes simplex tipo 2 (VHS-2) y contra el virus de inmunodeficiencia tipo 1 (VIH-1). Entre los compuestos responsables de esta actividad se puede nombrar a una molécula similar a la clorofila (feofórbido) aislada de Dunaliella primolecta, a un sulfolípido obtenido de Lyngbya lagerheimii y a una proteína de bajo peso molecular (cianovirín) aislada de Nostoc ellipsosporum.

Un grupo de científicos japoneses aisló de Spirulina platensis un polisacárido sulfatado, el calcio-spirulán, que presentó actividad contra el VHS-1 y el VIH-1. La actividad antiviral de esta molécula fue comparada con un sulfatodextrano mostrando una actividad superior. El calcio-spirulán inhibe la replicación del virus, creando una perturbación en las interacciones iónicas entre las membranas glicoproteícas del virus y los fosfolípidos presentes en las membranas de la célula del huésped, inhibiendo así la fusión celular de ambos. Asimismo, el calcio-spirulán mostró un tiempo de vida media en la sangre de ratón significativamente más largo (150 minutos) que el sulfatodextrano (30 minutos). Los resultados de este estudio son prometedores. El calcio-spirulán presenta todas las características necesarias de un buen antiviral: no estimula la replicación del virus, tiene actividad a bajas concentraciones, posee elevado tiempo de vida media en la sangre y tiene poca actividad anticoagulante. Aunado a esto, la tecnología del cultivo del género Spirulina está totalmente desarrollada, por lo que el abastecimiento de materia prima no presenta problema.

Queda, sin embargo, la puesta a punto de los procedimientos de extracción a nivel industrial de este principio activo. Un ejemplo de esto último lo tenemos en los trabajos realizados desde 1996 por un grupo de investigadores italo-franceses sobre la variación estacional de la actividad de los extractos de Schizymenia dubyi contra el virus VIH-1. Esta macroalga es una alga roja colectada en las costas de Sicilia cuya particularidad es la de poseer un elevado contenido de ácido gulurónico, un tipo de ácido no propio de las algas rojas. Esta alga contiene efectivamente un polisacárido denominado glucorono-galacto-sulfato, responsable de la actividad antiviral. Esta actividad disminuye en ciertas épocas del año (otoño-invierno) y llega al máximo de abril a julio, con la correspondiente disminución en el contenido de galactosa y sulfatos en el polisacárido (Freile, 2001).

 

IV. APROXIMACIONES EXPERIMENTALES

Existen sustancias generalmente de origen natural cuya efectividad biológica no puede ser determinada por sus propiedades químicas o fisicoquímicas. En ese caso, para evaluar su actividad, se emplean métodos de dosificación biológica. En estos se compara cuantitativamente el efecto de una muestra sobre un sistema biológico con el efecto producido por una preparación estándar en las mismas condiciones. Se obtiene así un valor de potencia relativo a un estándar de referencia.

Los dos métodos más comúnmente usados para evaluación de actividad antimicrobiana son:

a) Método turbidimétrico o ensayo en tubo:

Se basa en la incubación de un medio de cultivo líquido inoculado con un microorganismo sensible al antibiótico en presencia de una concentración conocida del agente antimicrobiano. Luego de un tiempo adecuado se detiene el crecimiento y se evalúa el mismo por medidas turbidimétricas. El uso de un espectrofotómetro o un fotocolorímetro para medir los cambios de densidad óptica en base a la mayor o menor turbidez producida por el crecimiento microbiano, evita la posible subjetividad de lecturas en una escala nefelométrica de McFarland. La base cuantitativa del ensayo es la relación entre la concentración del antibiótico y la densidad óptica del medio de cultivo en donde hubo crecimiento microbiano.

En los estudios de actividad antibacteriana de propóleo, para hallar la Concentración Mínima Bactericida (CMB), Ota y col. (1998) trabajaron a partir del liofilizado de dicha sustancia, el cual se suspendió en una solución hidroalcohólica con una concentración final de 50 mg/ml; de esta suspensión se dispensaron, en diferentes tubos, volúmenes de 0.1, 0.2, 0.3 hasta 1.0 ml y se completó a 5 ml con el medio de cultivo, obteniendo así concentraciones de propóleo desde 1 mg/ml hasta 10 mg/ml; luego se procedió a agregar a cada tubo 0.1 ml de inóculo bacteriano y se incubó a 37°C por 24 horas. Como la adición del propóleo ocasiona una turbiedad en el medio de cultivo, no fue posible observar el crecimiento bacteriano, por lo que de cada tubo se extrajo 0.1 ml y se sembró en tubos con caldo de cultivo puro que se incubaron a 37° C por 24 horas para observar si hubo crecimiento microbiano. Se concluyó que el propóleo presenta actividad antibacteriana in vitro siguiendo este orden de sensibilidad: Streptococcus mutans > Lactobacillus sp. > Sthaphylococcus aureus > Sthaphylococcus epidermidis.

En un trabajo de péptidos antimicrobianos, el MIC de cada péptido fue determinado por el uso de un ensayo de dilución en caldo del método de Amsterdam modificado. Diluciones seriadas de cada péptido fueron preparadas con ácido acético 0.01% en microplacas de 96 pocillos. Cada pocillo fue inoculado con 0.1 ml del organismo de prueba en Caldo MH a una concentración final de 2 x 104 a 105 UFC/mL (Friedrich y col., 1999). Este procedimiento permite cuantificar el MIC o concentración mínima inhibitoria como la primera dilución del extracto en la cual el crecimiento se inhibe después de un período de incubación (generalmente 18 horas a 37 ºC), y a la concentración mínima bactericida como la primera dilución en la cual ya no se detecta presencia de bacterias (Araujo y col., 2004).

b) Método de difusión en placa:

Se basa en la difusión radial de una solución de extracto o de antibiótico desde un reservorio a través de una capa de agar que ha sido inoculada con un microorganismo sensible al antibiótico. Se confrontan diferentes medidas de la sustancia a ensayar en placas con medios de cultivo sólido inoculado con microorganismos adecuados. Las placas se incuban para permitir el desarrollo del microorganismo. Durante la incubación, el antibiótico difunde desde su reservorio (que puede ser un disco de papel filtro, un pozo excavado en el mismo medio de cultivo con inóculo bacteriano, o pequeños cilindros colocados en la superficie del medio) mientras la población microbiana aumenta por división celular. La respuesta obtenida es una zona clara o halo de inhibición del crecimiento bacteriano en torno a los reservorios El límite de la zona de inhibición se forma cuando se alcanza la concentración crítica del antibiótico, es decir, la mínima concentración que inhibe el crecimiento de la población microbiana presente.

Los halos de inhibición se miden con la mayor precisión posible: se utiliza regla, vernier ó un sistema de ampliación de imagen y proyección sobre una pantalla. La base cuantitativa del ensayo es la relación entre el diámetro de la zona de inhibición y la concentración del antibiótico. La determinación de sensibilidad por difusión en agar es habitualmente suficiente; sin embargo, en ciertas situaciones se recomienda la determinación del MIC por métodos turbidimétricos (Harvey, 2000).

El gradiente de concentración es inversamente proporcional a la distancia de la fuente y depende del volumen de la sustancia en ella, y el crecimiento de microorganismos depende de la población inicial y de la velocidad de crecimiento.

Estudios con Rubus urticaefolius “mora”, utilizada en Centro y Sur América para el tratamiento de afecciones de la cavidad oral, demostraron una gran acción antibacteriana al efectuar extractos hidroalcohólicos, en especial del fruto. El método empleado para la determinación de la actividad fue el de Difusión en Agar con orificios. La extracción consistió en macerar separadamente hojas, tallo y frutos en solución hidroalcohólica al 70% durante 5 días a temperatura ambiente, y luego se eliminó el alcohol por evaporación (De Paula y Martínez, 2000).

Para un estudio de actividad antibacteriana y antifúngica de flavonoides y alcaloides de Lupinus ballianus c.p. smith “jera”, se obtuvieron extractos etanólicos de las hojas desecadas, de las cuales se extrajeron los principios activos mediante cromatografía. La determinación de la actividad antimicrobiana de flavonoides y alcaloides se realizó mediante el método de excavación en placa-cultivo utilizando el medio TSA y los microorganismos S. aureus, Bacillus cereus, Micrococcus luteus y Klebsiella pneumonae, además del hongo Aspergillus níger (Fuertes y col., 1997).

Mbwambo y col. (2007) trabajaron con extractos de raíz y tronco de Terminalia brownii. La prueba se realizó con el método de difusión en disco, usando extractos con solventes de diferente polaridad, yendo desde el éter de petróleo hasta agua. El resultado fue una nula actividad antimicrobiana en los extractos obtenidos con los solventes menos polares (éter de petróleo), y una actividad antimicrobiana incrementada en intensidad y número de especies bacterianas susceptibles conforme aumenta la polaridad del solvente. Lo más notorio de este trabajo es que el extracto acuoso mostró la mayor actividad antimicrobiana de todos los demás extractos, pero una menor acción toxigénica en bioensayos usando camarones de mar (los extractos acuosos son los más frecuentemente usados por los curanderos y naturistas). Se usaron discos de papel filtro (Whatman Nº1) de 5 mm de diámetro, impregnado con extractos crudos (5 µg/disco) o antibióticos estándar (10 mg/ml de gentamicina) o antimicóticos (20 µg/disco de clotrimazol), usando TSA o Sabouraud glucosado según el caso. La incubación se realizó a 37ºC por 24 horas. Se hace cada prueba por triplicado tanto para los extractos y los estándares, se toman promedio. Los reportes se realizan usando las medias de las zonas de inhibición (diámetros de inhibición menos diámetro del disco de papel, o sea 5 mm). El índice de actividad (IA) se calcula como la media de la zona de inhibición del extracto entre la media de la zona de inhibición producida por la droga estándar.

Estudios en aceites esenciales han demostrado actividad antibacteriana. En la UNMSM se extrajeron los aceites esenciales de tres plantas: Tagetes pusilla, Senecio tephrosiodes y Lepechinia meyenii, utilizando bacterias Grampositivas como S. aureus y Gram–negativas como Salmonella typhi, S. typhimurium, V. cholerae. Los aceites fueron extraídos por arrastre de vapor, y la actividad antimicrobiana fue llevada a cabo mediante el método modificado del cromatograma, realizándose las lecturas por medio de los halos de inhibición de los discos impregnados con el aceite. Los resultados mostraron acción antibacteriana frente a las bacterias evaluadas (Morales, 1996).

La alicina (allyl 2-propeno tiosulfinato) se produce durante la molienda de los dientes de ajo. Su formación depende de la enzima aliinasa presente en las células de la cáscara sobre la aliina de las células del mesófilo. La destilación al vapor de machacados de ajo durante la producción del aceite gárlico, usado con fines terapéuticos, producen metil y alil sulfoderivados de la alicina. Se ha considerado que la alicina es la responsable de la actividad antimicrobiana de los homogenizados de dientes de ajo (y del aceite gárlico) sobre Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Helicobacter pylori. Se usó la técnica de difusión radial en placa usando agar TSA, con una incubación de 48 horas a 37º C. Las placas, previamente al uso de los extractos, fueron preparadas conteniendo el cultivo bacteriano y fueron dejadas en reposo dentro de un extractor de aire seco a fin de evitar la pérdida de actividad del ajo por volatilización. Además, este trabajo ha demostrado que al enfrentar el aceite gárlico con el cultivo bacteriano se debe tener en cuenta la naturaleza hidrofóbica del aceite, por lo que estudios anteriores no mostraron actividad antibacteriana (Ross y col., 2001).

En Cuba se estudió la actividad antimicrobiana de diferentes concentraciones de un extracto fluido (etanol 80%) de hojas de “copal” Schinus terebinthifolius. Se utilizaron cepas ATCC de microorganismos que incluyen a Staphylococcus aureus como Gram-positivas y Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa como Gram-negativas, y la levadura Candida albicans. El método utilizado fue el de excavación en placa y difusión en agar para adicionar los extractos.

El inóculo de microorganismos precultivados en medio líquido permitió un crecimiento en césped en el agar con una concentración de 108 cel/mL. Las placas se incubaron a 37ºC durante 24 horas, y luego se evaluaron los resultados mediante la lectura en milímetros del diámetro del halo de inhibición de crecimiento. Los resultados obtenidos mostraron que aun a la menor concentración (1%) se aprecia inhibición del crecimiento de todo microorganismo y la respuesta es incrementada gradualmente con la concentración hasta el 80% (Martínez y col., 2000).

Los resultados de un trabajo sobre actividad antibacteriana de propóleos argentinos demostraron la influencia de la vegetación en la composición química y, como consecuencia de ello, en la actividad biológica; es decir, la composición de los propóleos varía de acuerdo a su origen botánico y fitogeográfico. El objetivo de este estudio fue determinar la validez del uso popular de propóleos como agentes antibióticos. Para dicho ensayo, se obtuvo un extracto etanólico de propóleos en el cual se embebieron discos de papel Whatman Nº 4 (5 ml) y luego se colocaron en placas con agar MH conteniendo la suspensión bacteriana apropiada. Los discos contenían cantidades variables del extracto de propóleo; las placas se incubaron a 37ºC por 24 horas, y se probaron cepas de bacterias como S. aureus, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli, entre otras. Los resultados se interpretaron por los halos de inhibición de crecimiento bacteriano, y el MIC se determinó con un software basado en la ecuación de Michaelis-Menten. Se observó que todos los propóleos mostraron actividad antimicrobiana sobre las bacterias Gram-positivas y no sobre las Gram-negativas (Ota y col., 1998).

Para obtener un ensayo de acción bactericida, Friedrich y col. (1999) tomaron por toda la noche un cultivo de E. coli y lo diluyeron hasta 10-2 en caldo MH fresco, dejándolo crecer hasta la fase logarítmica (D.O600 0.6) o estacionaria (D.O600 de 2) para luego diluirlo en medio fresco, produciendo una concentración de trabajo de 108 cel/mL. Los péptidos o antibióticos a ensayar fueron adicionados a 4 veces sus MICs, y estas suspensiones fueron incubadas a 37ºC después de la adición del péptido. Las muestras fueron removidas a intervalos regulares, diluidas y plaqueadas sobre placas de agar MH para obtener un conteo viable.

La investigación de tioglicósidos en plantas del género Tropaeolum demostró que dichos metabolitos poseen actividad antimicrobiana y antifúngica. Para determinar la actividad antimicrobiana, se aplicó la técnica de dilución en placas de Agar, con diferentes concentraciones del extracto etanólico puro obtenido de hojas, flores y frutos de Tropaeolum majus (los extractos contienen el tioglicósido y sus productos de hidrólisis determinados mediante cromatografía y la formación de derivados). Las pruebas antibacterianas se efectuaron con cepas de S. aureus, E. coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumonae y Proteus vulgaris. Para comprobar la actividad antifúngica, se hicieron pruebas cualitativas utilizando la técnica de difusión en placas de agar, y en tubos para determinar la concentración mínima inhibitoria.

Se utilizaron cepas de hongos dermatofitos y Candida albicans. Se concluyó que los extractos etanólicos y acuosos de hojas, flores y frutos tienen un metabolito secundario (mayor en frutos) que se agrupa dentro de los glicósidos. Las hojas, flores y frutos presentaron actividad antimicrobiana y antifúngica (Cumpa y col., 1991).  

 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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